中空纤维切向流过滤：高效纯化无脊椎血红蛋白
简介
输血是临床上最常使用的治疗手段之一，但其常面临季节性短缺以及特殊血型献血不足等问题，在缺乏特定检测及储存设备的欠发达地区，该问题尤为严重。为解决输血制品的经济、安全及供应问题，近年来，科学家开始关注于血红蛋白氧载体（HBOC）的开发。传统的HBOC来源主要为哺乳动物，虽具有极大临床潜力，但在制备过程中，不可避免地出现诸多副反应，如血红蛋白（Hb）四聚体解聚，从而渗出血管或肾小管壁，引起组织或肾脏毒性；又或Hb被氧化，失去携氧能力；纯化的Hb也易受一氧化氮（NO）的影响。
陆生蚯蚓（Lumbricus terrestris）没有红细胞，但含有一种独特的血红蛋白，称为无脊椎动物动物血红蛋白（LtEc），其是由144个Hb亚单位和36个交联蛋白组成的大分子，非常稳定，耐氧化，已有实验证明，LtEC可在小鼠及大鼠体内运输O2，而无明显长期副作用，所以被认为可用于替代捐献来源人体红细胞。
LtEc应用的前提是建立安全、高效的制备工艺，曾有实验尝试使用体积排阻层析和超速离心，但收率和规模放大性都差强人意。本文尝试使用切向流过滤（TFF）纯化LtEc，并测试所得产物的纯度、产量、粘度、高铁血红蛋白水平、胶体渗透压、氧结合平衡以及配体结合动力学等参数，并进行仓鼠输血实验，检测了产物的安全性。
实验
每批次实验使用2L蚯蚓，漂洗去除泥土和粘液后，均质匀浆，去除固体碎片，上清液再离心后，滤纸过滤，去除较大的颗粒。
初步澄清过滤采用两根并联的0.2μm中空纤维切向流过滤组件（产品编号：M1-M02E-360-F1S；膜表面积：1050cm2；膜材质：PES），得到2L滤液；滤液先用500kD中空纤维切向流过滤组件（产品编号：M2-500S-100-01P;膜表面积：1050cm2；膜材质：PS）浓缩至200ml；回流液再进行10体积洗滤，前8体积使用Tris缓冲液，后2体积改用改良乳酸林格式溶液。洗滤采用间断模式，即先稀释至2L后，再浓缩至200ml。最后1体积洗滤后，回流液浓缩至20-50ml，再用0.22μm针头式滤器除菌过滤。整个切向流过滤工艺流速均稳定为480ml/min。
纯化后的样品采用SDS-PAGE分析蛋白浓缩，以*化高铁血红蛋白测定法检测氧化LtEc（MetHb）水平，以MALDI-MS分析样品分子量，以血分析仪分析O2平衡曲线和结合/解离动力学，并测试产物粘度和胶体渗透压。
此外，使用仓鼠进行纯化LtEc的超容量输血实验，输血过程监测血浆蛋白浓度，并监测平均动脉血压（MAP）、心率（HR）、功能性毛细血管密度（FCD）、动/静脉血液流速等指标。
结果
SDS-PAGE结果显示，使用0.2μm过滤器进行澄清可去除大分子量的凝血蛋白聚合物等杂质，多次洗滤后，小分子杂质亦可去除，而LtEc被浓缩，且所得产物条带分子量与理论值基本一致。
MALDI-MS结果也证明，所得产物分子量与理论值符合，且无较大杂质峰存在。每批次LtEc的收率为5g左右，且metHb含量极低（~3%）。说明TFF在保证收率的同时，可最大程度地维持LtEc的稳定性。纯化LtEc的O2亲和性（P50）与bHb或人全血相似，O2释放常数也无太大差异，而CO结合常数显著较低，也不易受NO攻击。
实验通过仓鼠输血模型检测纯化LtEc的安全性，结果显示，无显著免疫或过敏反应发生，从MAP及血管直径参数看，LtEc不会造成血管紧缩或高血压，反而在较高血浆浓度条件下，血管会轻微舒张。LtEc不会引起HR降低，升高浓度后，动脉血液流速加快，此外，一定浓度的LtEc可增加FCD，说明其可纠正失血性休克时的毛细血管塌陷问题。
讨论
TFF纯化工艺可用于制备高纯度的完整LtEc，且纯化的LtEc可有效结合并释放O2，其O2亲和性与人体全血相近，而不易受CO攻击，表明其是高效的体内O2载体。纯化LtEc的粘度和COP也与人体全血接近，这使其在输血治疗出血性休克时，可将液体有效驱入毛细血管，提高循环体积，维持FCD，恢复O2输送。在仓鼠输血实验中，也未观察到高血压、血管紧缩或过敏反应等现象，证实了纯化LtEc的安全性。可见，TFF是LtEc纯化的高效手段，可进行进一步的规模放大实验。