近年来，随着基因编辑技术的迅速发展和广泛应用，越来越多的儿科疾病及其他遗传代谢疾病应用斑马鱼基因编辑技术，为开发治疗多种儿科疾病的疗法提供支持，助力儿科遗传疾病临床研究！

斑马鱼作为发育生物学中的经典模式生物，它在儿科疾病研究中具有天然的优势，越来越受到该领域研究人员的广泛应用。其研究优势包括：胚胎发育快，可显著缩短研究周期；体外受精和发育，透明易观察和活体成像；多种稳定的转基因报告品系供研究人员在多个方向开展研究；养殖容易且产卵量大，可用于高通量筛选；遗传操作方便，且有多种方法供选择等。今天，我们一起来解读斑马鱼基因编辑技术在儿科遗传疾病研究中的应用案例——

斑马鱼在儿科疾病中的研究案例

The Cases Study In Childhood Disease

01、用于先天性畸形遗传疾病研究

研究对象：特定基因及点突变等在先天性畸形中的功能和机制

目前已报道MAP4K4与多种信号通路有关，MAP4K4的缺失会导致胚胎发育异常，而表达水平升高与癌症、动脉粥样硬化和糖尿病等多种疾病有关。该研究报告了21个表现出神经发育差异和多种先天性异常的家族，其在MAP4K4中携带一系列罕见的突变。进一步，该研究使用多种斑马鱼模型验证了MAP4K4不同突变导致不同发育缺陷。

此外，利用斑马鱼胚胎开展分子机制研究发现MAP4K4负向调控RAS在胚胎早期的信号通路。该研究表明斑马鱼胚胎模型不仅能快速且规模验证特定基因及其多种突变形式在先天性畸形中的功能研究，而且可用于活体研究特定基因在早期胚胎发育过程中的作用分子机制。

图1

如图1所示，斑马鱼胚胎中通过显微注射异位表达MAP4K4及其突变体导致胚胎发育畸形。A、MAP4K4及其突变体异位表达导致发育缺陷，包括颅面异常（CFAs；闭合箭头）、脑积水（白色箭头）和泄殖腔缺陷（闭合正方形）。根据突变体在蛋白质中的位置排列（从上到下；N到C末端）。B-F，统计的异常表型包括体型、眼睛、心脏、卵黄、体长。

来源：Patterson et al., 2023, Sci. Adv

02、用于儿科血液系统研究

研究对象：特定基因在白血病发生中的功能和作用机制

急性淋巴细胞白血病是一种常见的侵袭性儿童血液癌症，在临床急性淋巴细胞白血病患者中发现IL7R存在功能获得型突变，但是该突变能否驱动白血病的发生，以及它是否与其它癌基因在白血病中有协同作用仍不清楚。利用斑马鱼模型中的转基因和细胞移植等方法，该研究揭示单独的IL7R功能获得型突变可诱导T细胞急性淋巴细胞白血病，进一步机制研究发现IL7R与MYC对于T细胞急性淋巴细胞白血病的发生有协同作用，且IL7R通路的激活增加了MYC诱导的T细胞急性淋巴细胞的扩散。

该研究表明斑马鱼模型不仅能快速验证急性淋巴细胞白血病相关的致病基因，而且可用于活体研究白血病致病基因发挥功能的分子机制。

图2

如图2所示，T细胞中过表达IL7R功能获得型突变可诱导T淋巴细胞增生（红色荧光标记T淋巴细胞），以及表现出T细胞急性淋巴细胞白血病特征（细胞涂片、苏木精-伊红和凋亡染色）。

来源：Oliveira et al., 2022, Leukemia

图3

如图3所示，T细胞中同时过表达MYC和IL7R功能获得型突变显著加速了T细胞急性淋巴细胞白血病的发生（红色荧光标记、细胞涂片、苏木精-伊红和凋亡染色）。

来源：Oliveira et al., 2022, Leukemia

03、用于儿科免疫系统研究

研究对象：特定基因在结核分枝杆菌易感性中的功能和机制

结核分枝杆菌感染在宿主中产生的反应并不相同，如抵抗感染、进展为感染性疾病，这其中的原因却并不明确。通过易感的病人和动物模型的遗传研究暗示宿主的遗传差异性在结核分枝杆菌易感性中发挥关键作用。斑马鱼幼鱼阶段不仅胚胎透明，且仅先天免疫系统发挥功能，这非常有利于研究先天性免疫系统在结核分枝杆菌易感性中的作用。

该研究基于斑马鱼幼鱼感染模型的研究优势，同时借助于斑马鱼规模化正向遗传筛选方法，获得了对结核分枝杆菌具有不同先天易感性模式的多个突变类别。其中，一个高敏感突变体定位于lta4h基因座，该基因产物催化合成一种强效化学引诱剂和促炎类二十烷LTB4。然而，机制研究发现lta4h基因突变导致的超易感性不依赖于LTB4减少，而是通过将类花生酸底物重定向至抗炎症脂毒素，由此产生的抗炎症状态通过限制肿瘤坏死因子的产生来增加分枝杆菌的增殖。进一步在临床病人分析也发现对结核病和多菌麻风病的保护作用与LTA4H多态性相关。

该研究表明斑马鱼模型不仅便于特定基因在感染中的功能和作用分子机制研究，而且可通过规模化的遗传筛选在活体中发现新的感染相关基因。

图4

如上图4所示，下调lta4h增加斑马鱼幼鱼对结核分枝杆菌的易感性。A，B、瞬时敲降lta4h增加结核分枝杆菌感染的数量（荧光显示和统计分析）。C、易感性斑马鱼幼鱼感染结核分枝杆菌后存活率显著降低。D，E、瞬时敲降lta4h增加结核分枝杆菌在特定位点的聚集（荧光显示和统计分析）。F-H，通过药物bestatin抑制lta4h同样导致斑马鱼幼鱼对结核分枝杆菌的易感性（数量、荧光、聚集）。

来源：Tobin et al., 2010, Cell

04、用于儿科神经系统发育研究

研究对象：特定基因在儿童神经系统发育中的功能和机制

到目前为止，科学家已发现多种单基因遗传疾病，但是，一半以上的可能遗传因素导致的严重发育障碍儿童仍然未能得到遗传诊断，尤其是罕见的离散的遗传疾病疾病。

该研究应用无偏见的基因型驱动分析方法来区分患有类似疾病的患者子集，从1133名患有严重、未确诊发育障碍的儿童及其父母，结合外显子组测序和基于阵列的染色体重排检测，我们发现了12个与发育障碍相关的新基因。在此基础上，借助于斑马鱼瞬时敲降技术快速验证了7个基因与神经系统发育相关。该研究表明斑马鱼模型可用于快速验证临床上发现的特定基因和突变在儿童神经系统发育中的功能，进一步还可利用斑马鱼研究技术活体揭示相关基因的作用分子机制。

图5

如上图5所示，斑马鱼中瞬时敲降小头畸形患者中存在变异的七个基因同样导致斑马鱼神经系统发育缺陷。对照和基因敲降胚胎的明场图像显示头部大小显 著减小；神经元抗体染色（抗HuC/D，绿色荧光）标记显示对照和基因敲降组斑马鱼大脑变小。

来源：Fitzgerald et al., 2014, Nature

05、用于左右不对称系统发育研究

研究对象：特定基因在先天性心脏缺陷的异位综合征中的功能和机制

异位综合征是由左右体畸形引起的先天性疾病，大约90%的异位症患者患有严重的先天性心脏病，然而大多数病例的潜在的病因和机制仍然未知。该研究从63个散发性异位综合征患者，通过分析罕见拷贝数变异（CNVs）发现了6个新的候选基因。通过斑马鱼幼鱼整体原位杂交显示这六个基因在胚胎发育早期表达，基因瞬时敲降和过表达的实验揭示这6个基因与斑马鱼心脏环化相关。进一步通过斑马鱼模型开展深入的分子机制研究发现，这些基因可能通过调节下游pitx2和lefty2在侧板中胚层中的表达来影响心脏环化。

该研究表明斑马鱼模型可用于快速验证临床上发现的特定基因在异位综合症和心脏缺陷疾病中的功能，进一步还可利用斑马鱼研究技术揭示相关基因的作用分子机制。

图6

如上图6所示，斑马鱼中瞬时敲降或异位过表达异位综合征候选基因导致心脏环化异常。A、心脏环化正常和异常表型。B吗啡啉介导的瞬时敲降导致心脏环化异常。C、CRISPR/Cas9介导的瞬时敲降导致心脏环化异常。D、mRNA异位过表达导致心脏环化异常。E、过表达可部分挽救基因敲降导致的心脏环化异常。

来源：Liu et al., 2018, Genome Medicine

06、用于非综合征型唇腭裂疾病研究

研究对象：特定基因在非综合征型唇腭裂发生中的功能和机制

非综合征型唇颚裂是一种常见的严重颅面畸形，目前大约有25%的该疾病通过连锁、候选基因和全基因组关联研究确定跟遗传变异相关。该研究采用全基因组测序和全基因组基因分型，然后进行多基因风险评分（PRS）和连锁分析，确定一个三代大家族中非综合征型唇腭裂的遗传病因——PDGFRA中一种罕见的错义变体（c.C2740T；p.R914W）。进一步利用转基因斑马鱼品系结合瞬时敲降技术以及抑制剂药物揭示下调PDGFRA导致非综合征性型唇腭裂疾病的发生。

该研究表明斑马鱼模型可用于快速验证临床上发现的特定基因在唇腭裂疾病中的功能，进一步还可利用斑马鱼研究技术检测和研究相关基因可能的作用分子机制。

图7

如图7所示，斑马鱼幼鱼中下调PDGFRA导致非综合征型唇腭裂疾病的发生，包括CRISPR/Cas9介导的基因敲降和药物抑制PDGFRA信号通路。

来源：Yu et al., 2022, Human Molecular Genetics

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