斯坦福大学医学院的遗传学教授Michael Snyder及其同事利用Pacific Biosciences系统，对三个家庭成员的类淋巴母细胞转录组进行了测序，并将获得的reads与Illumina平台上获得的较短reads进行比较。通过这些转录组，他们开发出一名家庭成员的等位基因特异的全长转录组。
斯坦福大学的研究人员利用一种基于long-read的方法，生成了个人的转录组。这项成果于近日发表在《美国国家科学院院刊》上。
文章的通讯作者是斯坦福大学医学院的遗传学教授Michael Snyder。他的实验室主要利用各种方法来分析基因组及调控网络。他们的研究对象包括酵母和人类。Snyder教授曾在《Cell》、《Science》、《Nature》等杂志上发表了多篇具有影响力的文章。
在这项研究中，Snyder及其同事利用Pacific Biosciences系统，对三个家庭成员的类淋巴母细胞转录组进行了测序，并将获得的reads与Illumina平台上获得的较短reads进行比较。通过这些转录组，他们开发出一名家庭成员的等位基因特异的全长转录组。他们能够区分两个等位基因，即使是复杂的基因如HLA。
研究人员在文章中写道：“据我们所知，我们生成了最深且最长的单分子long-read数据集。”他们认为，这种个人的转录组，将对了解个体生物学和疾病很重要。
Snyder及其同事利用PacBio平台，对GM12878细胞系的大约711,000个环化一致分子（circular consensus read molecules）进行测序。他们产生了较长的reads（平均读长为1,188 bp），这比去年他们在《Nature Biotechnology》上展示的人体器官panel的数据集更长（平均读长为999.9 bp）。
他们也指出，尽管两个数据集都同样产生了较短的分子（长度介于0.8 kb和1.3 kb），但是现有的数据集更好地代表了长于1.7 kb的分子。
此外，这个斯坦福的团队也在Illumina的平台上对100 M个101 bp的双端reads进行测序，并利用Cufflinks开展分析。
这两种技术都发现了约99,000个带注释的外显子-外显子接头，且Illumina的reads发现了额外92,000个注释接头，而PacBio的reads发现了额外992个。此外，对于22,600个被Gencode归为蛋白编码基因或lincRNA的剪接基因，long-read的单分子测序和101 bp的双端测序同时鉴定出其中的9,200个。long-read还发现了40个基因，双端测序发现了6,400个基因，而还有7,000个基因利用两种方法都未发现。
研究人员推测，由于环状一致read的产生需要读长至少是cDNA长度的两倍，故consensus split-mapped molecules（CSMM）不包含大量较长的基因。
研究人员表示，转录组学研究的目标是能够指定表达RNA分子的等位基因。他们认为，long-read测序应该能够确定影响单个RNA分子的每个SNV。
为了追踪在GM12878子细胞系中发现的这些等位基因的来源，他们合并了GM12891和GM12892母细胞系的数据，并研究了子代中存在的SNV是否存在于亲代数据中。
通过主成分分析，他们能够分离出两个等位基因。对于166个注释有两个杂合SNP的基因，研究人员发现其中的158个有两个或以上的SNP，2个基因有一个SNP，而6个基因似乎不是杂合的。
一些基因，尤其是HLA基因，包含多个SNP，而对于它们，研究人员基本能够确定相位。“即使是复杂的基因（如HLA基因，其序列可能与参考序列相差甚远），两个等位基因通常也是清晰可辨的，”Snyder及其同事写道。
原文检索
Defining a personal, allele-specific, and single-molecule long-read transcriptome
Published online before print June 24, 2014, doi: 10.1073/pnas.1400447111 PNAS June 24, 2014