病料采集
病料，是在进行疾病诊断或检疫时，从患病个体采集的可供检测分析的材料样品。病料采集是否得当，直接关系到检验结果是否正确。有时对不同疾病要采集不同的样品，差异很大。
1、采集病料时应遵循如下原则
（1）适时采样：根据检测要求、检测对象和检验项目的不同，选择适当的采样时机十分重要。样品是有时间要求的，应严格按规定时间采样；有临床症状需要做病原分离的，样品必须在病初的发热期或症状典型时采样；病死的猪应立即采样，最长不能超过6小时。
（2）合理采样：根据诊断检测要求，除严格按照规定采集各种足够数量的样品外，不同的疫病所需检测的样品有所区别，应按可能的疫病侧重采集。对于未能确定为何种疫病时，应全面采集。数量除满足诊断检测的需要，还应留有余地，以备必要时复检使用。
（3)典型采样：选取未经治疗、症状最典型或病变最明显的病例，如果有并发症，还应兼顾进行采样。
（4）无菌采样：采集的检验样品除供病理组织学检验外，还供病原学与血清学检验，所以必须无菌操作采样，采样用具、容器均须灭菌处理。尸体剖检需采集样品的，先采样后检查，以免人为污染样品。
（5）样品处理：采集的样品应一种样品一个容器，立即密封，根据样品的性状及检验要求不同，做暂时的冷藏、冷冻或其他处理。供病毒学检验的样品，数小时内要送到实验室，只做冷藏处理，超过数小时的应冻结处理。冻结方法：可将样品放入-30°C冰箱内冻结，然后再装入有大小冰块或干冰的冷藏箱内运送；也可将装入样品的容器放入隔热保温瓶内，再放入冰块，然后按100克冰块加入食盐约35克，立即将保温瓶口塞紧。供细菌学检验或血清学检验的样品冷藏送实验室即可。
（6）安全采样：采样过程中，须做好采样人员的安全防护，并防止病原污染，尤其必须防止外来疫病或重大疫病的扩散，避免事故发生。
（7）样品包装：装盛样品的容器可选择玻璃或塑料的，可以是瓶子、试管或袋子。容器必须完整无损，密封不使液体漏出。装供病原学检验样品的容器，用前应彻底清洗干净，必要时经清洁液浸泡，冲洗干净后以干烤或高压灭菌并烘干。如用塑料容器，能耐高压的经高压消毒，不能耐高压的经EO熏蒸消毒或紫外线消毒灭菌后使用。
（8）迅速送检：样品经包装密封后，必须尽快送往实验室，延误送检时间，会影响诊断结果。供细菌检验、寄生虫检验及血清学检验的冷藏样品，必须在24小时内送到实验室；供病毒检验的冷藏处理样品，须在数小时内送达实验室，经冻结的样品须在24小时内送到，24小时内不能送到实验室的，需要在运送过程中保持样品处于-20°C以下。

2、病料的采取方法
（1） 脓汁——先将表面流水线，然后以灭菌注射器或吸管抽取深部的浓汁;若是开口化脓灶或皮肤,粘膜表面化脓,可用灭菌棉拭子浸沾脓汁后,放入试管中。
（2）内脏器官——采取心、肺、肝、脾，肾等有病变的组织及其淋巴结，无病变时也要采取，无菌剪取1-2cm大的方块,分别装入灭菌容器内。
（3）血液——要全血时,无菌采取血液10m，立即注入盛有含0.5%肝素溶液0.1ml或5%柠檬酸钠液1ml的灭菌试管内，并立即混合均匀。要分离血清时，将无菌采取的血液直接注入灭菌试管，待血液自然凝固后分离血清。从尸体采取血液时，可用灭菌注射器或吸管从右心房抽取。
（4）皮肤和粘膜——采取病变局部的皮肤和粘膜及其所属淋巴结，放入甘油盐水溶液中。
（5）脑和脊髓——无菌采取脑的脊髓约1-2cm大的方块，放入甘油盐水溶液中。
（6）胆汁——用灭菌注射器抽出后放入灭菌试管中。
（7）肠和胃——剪取有病变的部位一段或一块。也可将肠管一段(约6-8cm)用线扎紧两端后剪下送往实验室。
（8）粪便——可用棉拭子插入肛门沾取，或扑杀病畜后由肠管采取，立即放低温条件下保存。
（9）乳汁——先用消毒药液洗净乳头及其附近，弃去最初挤出的几滴乳汁，然后采取乳汁约10ml放入灭菌试管内。
（10）流产胎儿——可将整个胎儿用塑料薄膜包紧，装入箱中送检。
（11）小动物、禽和鱼等，可按上述流产胎儿方式整体送检。在距离实验室很近，又有隔离运输条件时，也可将发病小动物直接送检。

3、病料的处理
（1）初步观察：
采集的病料，在接种培养前，应对其性状进行观察，例如：是否脓性带血或腐败，有何异味，并作记录。各种病料在分离培养前均应制备一张涂片，作革兰氏染色、镜检，以了解细菌的形态，染色特性，并大致估计其含菌量。通过肉眼观察和显微镜下看到的结果，对病料中可能含有的病原菌作最初步的估价。
（2）处理判断：
如果病料是病变组织，又是用无菌方法采集的，在接种前一般无需作特别处理。
但如果病料被杂菌污染严重，则需根据要分离的病原菌的特性，采用一些对病原菌无害，但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法，以抑制杂菌生长。
⚪例如从粪便中分离沙门氏杆菌，可将粪合接种于Na2SeO3肉汤中，作增菌处理。在这种培养基中，其它杂菌被抑制，而沙门氏杆菌则能自由繁殖。
⚪又如，分离布鲁氏杆菌、胎儿弯曲杆菌、炭疽杆菌、副结核杆菌可用选择性抗菌琼脂。分离链球菌和猪丹毒杆菌用叠氮钠结晶紫血琼脂等。
⚪如果从肠道内容物或从污染有不产生芽胞的杂菌培养物中分离能形成芽胞的细菌(如魏氏梭菌,破伤风梭菌等)，可将病料在80℃加热15分钟，以杀死不形成芽胞的杂菌，取此材料再接种培养基，即容易获得纯培养物。
⚪如有些病料(奶，尿等)含菌太少，则应先作集菌处理，然后接种，以提高检出率，其集菌方法有离心法和过滤法。离心法取沉淀物作培养物，过滤后取沉积于滤板上表面的病料作培养。
⚪还有些细菌往往在细胞浆内集结成团，在它们所形成的病灶中含菌较少，遇到这种情况，可将病料组织磨碎，制成乳剂，加入酶、酸或碱，消化组织，使菌团散开，然后离心，收集沉淀物作培养(如从肠粘膜分离副结核杆菌即用此法)。

细菌分离培养的基本条件包括接种用具(接种环、接种针)、培养箱、培养基，以及无菌室和超净工作台等。
1、接种用具

耐思 1ul/10ul 接种环、接种针

包括接种环和接种针两类。接种环用来挑取标本、菌液及平板划线等。接种针则用来挑取单个菌落，穿刺高层琼脂等。
接种环(针)由环(针)、金属柄和绝缘柄3部分组成，环(针)一般采用铂丝制作最佳，其硬度适宜，易于传热，火焰灭菌后冷却快，经久耐用。但因其价格昂贵，目前多用电热(镍)丝及一次性塑料接种环代替。
接种环的直径一般为2～4mm，长5～8cm，定量接种环容量为1/300ml、1/200ml、1/100ml，用于定量培养。


2、培养箱
（1）普通培养箱，可自动调节培养温度(一般为35～37℃)，用于培养普通需氧或兼性厌氧菌。
（2）二氧化碳培养箱，可自动调节二氧化碳浓度(一般为5％～l0％)和培养温度，用于分离培养嗜血杆菌和奈瑟菌等生长时需二氧化碳的细菌，尤其是初次分离培养时。如无二氧化碳培养箱时，也可用烛缸法代替。
（3）厌氧袋、厌氧罐(盒)和厌氧手套箱用于分离培养厌氧菌。厌氧袋为透明的、不透气的塑料袋。厌氧罐为密封的塑料或玻璃罐(盒)，可用物理或化学方法去除袋、罐中的氧气，达到无氧状态。厌氧手套箱则可通过换气装置快速达到、持续保持无氧状态，并自动调节培养温度，还可通过手套在箱内进行分离接种、生化鉴定等操作。


3、培养基

耐思 500ml/1000ml 试剂瓶

培养基(culture medium)是由人工方法配制而成的，适合微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。适宜的培养基不仅可用于细菌的分离纯化培养、传代、菌种保存，还可用于研究细菌的生理、化学特性，是对病原菌分离鉴定的重要环节和必不可少的手段。培养基按其性状分为固体、半固体和液体培养基；按其用途分为基础、营养、选择、鉴别和特殊培养基。
（1）基础培养基(based medium) 含有基础生长所需的基本营养成分，最常用的是肉浸液，主要成分含牛肉浸液和蛋白胨。基础培养基广泛用于细菌的增菌、检验，也是制备其他培养基的基础成分。
（2）营养培养基(nutrient medium) 在基础培养基中加入葡萄糖、血液、生长因子等特殊成分，供营养要求较高的细菌和需要特殊生长因子的细菌生长。最常用的是血琼脂平板、巧克力平板等。
（3）选择培养基(selective medium) 在培养基中加入选择性抑制物质，有利于目的菌的检出和识别，而抑制其他非目的菌。例如，麦康凯琼脂平板可以抑制球菌及革兰阳性杆菌生长，有利于肠道菌生长，称弱选择性培养基；SS琼脂平板除有上述作用外，还可抑制肠道非致病菌的生长，故称强选择性培养基。
（4）鉴别培养基(differential medium)利用细菌分解糖类和蛋白质的能力及其代谢产物的不同，在培养基中加入特定的作用底物和指示剂，用于观察细菌各种生化反应，以鉴别和鉴定细菌。例如糖发酵管、克氏双糖铁琼脂(KIA)、伊红-亚甲蓝(美蓝)琼脂等。
（5）特殊培养基(special medium) 包括厌氧培养基和细菌L型培养基等。前者是培养专性厌氧菌的培养基，除含营养成分外，还加入还原剂以降低培养基的氧化还原电势。后者是针对细胞壁缺损的细菌L型，由于胞内渗透压较高，故培养基必须采用高渗低琼脂培养基。

为了从临床标本中分离出病原菌并进行准确鉴定，除选择好合适的培养基外，还要根据待检标本的来源、培养目的及所使用培养基的性状，采用不同的接种方法。

耐思 细菌皿
底部3/6/9/12点处有数字标记，方便确定细菌位置

1、平板划线分离法
使标本或培养物中混杂的多种细菌在培养基表面分散生长，各自形成菌落。一般要求单个菌落是一种细菌的纯培养。但很多情况下单个菌落并非只有一种细菌，特别是标本直接划线的开始区域生长的单个菌落分离结果不纯，一般选择菌落形成较稀少区域的单个菌落，必要时先稀释标本再划线。待菌落长出后，挑选单个菌落，转种到另一培养基中，继续实验。平板划线法可分为以下几种：
（1）分区划线法——此法多用于粪便等含菌量较多的标本。先将标本均匀涂于平板表面边缘一小部分(第1区)；然后烧灼接种环，将环通过第l区3～4次，连续划线(为第2区)；依次划3、4区。平板上每区的细菌数会逐渐减少，直至分离出单个菌落(图5-4)。
（2）连续划线法——本法一般用于接种含菌数量相对较少的标本或培养物。先将标本均匀涂布于平板边缘一小部分，并由此开始，在平板表面连续划线并逐渐下移，直至划满平板表面。
（3）棋盘格划线法——此法多用于含菌量较多的临床标本，如痰、粪便等标本的初代分离培养。其优点是整个平板的3/4～4/5区域(即棋盘格范围)均为有效分离区。将标本涂布于平板约1/5处，接种环经火焰灭菌后，自原处做平行划线5～6条。接种环烧灼后冷却，划垂直线5～6条，形成正方形格；再以同法划两排斜线，使呈棋盘形。

2、斜面接种法
该法主要用于纯种增菌及保存菌种。挑取单个菌落从斜面底部自下向上划一条直线，再从底部开始向上划曲线接种，尽可能密而匀，或者直接自下而上划曲线接种。
3、液体接种法
以接种环沾取菌种，倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体应淹没接种物为准)。多用于普通肉汤、蛋白胨水等液体培养基的接种。
4、穿刺接种法
此法用于保存菌种、观察动力及某些生化反应。以接种针挑取细菌培养物，插入半固体培养基的中央，穿刺至培养基底部，然后沿原穿刺线退出接种针。其他操作与斜面接种类似。
5、倾注平板法
取纯培养物的稀释液或原标本，混匀于已融化并冷却到50℃左右15ml的琼脂管中，无菌法倾注于无菌平皿，凝固后培养，进行菌落计数。该法适用于兼性厌氧菌或厌氧菌稀释定量培养，也用于饮料、牛乳和尿液等液体标本活细菌计数。

1、细菌室注意事项
（1）细菌室必须经常保持整洁，装有供空气消毒的紫外线灯，每天开始工作前，照射20分钟。入室前要着白大衣、戴帽子、口罩，并做好实验前的各项准备工作。必须进行登记、编号后才能进行检验。
（2）实验用具用完后一律放回原处，已污染的用具应立即置5%的来苏儿罐或烧灼后再行高压灭菌。未污染之纸绳、火柴杆等应集中扔在污物桶内。
（3）分离的一类或二类菌种，除按卫生部1985年颁发的《中国医学微生物菌种保藏管理办法》执行外，未经领导批准，不得带出实验室或擅自处理。
（4）工作人员进入实验室不得携带书籍和资料，实验室其他特件在保证不污染、安全的前提下方可带出。
（5）应在指定房间进行强毒操作或感染动物。实验者除着白大衣外，要着前挂，戴口罩、眼镜、胶皮手套和穿胶鞋，工作结束后应彻底消毒。
（6）在操作污染材料时，如有事故发生（如打破平皿、注射针头脱落喷出感染材料等），所有被污染的物品及工作人员不得擅自离开原地，应就地呼唤他人彻底消毒后方可离开原地。
（7）工作人员于操作中感染病原菌或认为可能感染时，必须立即报告领导，尽速采取预防或隔离治疗等措施。
（8）一类病原菌检验必须在强毒室操作，操作此类细菌应由实际工作3年以上的细菌检验人员担当，操作时应当有两名以上人员。
（9）细菌检验操作必须严格遵守有关制度及操作规程，加强消毒和无菌观念，以免发生意外。

2、操作注意事项
（1）由被检验标本或培养物中取材观察细菌形态时，必须使用接种环。接种环系采用一段长约5～8cm硬度适中的镍质电阻丝或特制铂丝，安置在一金属或玻璃棒上制成。无环者则称接种针。
（2）接种环或接种针每次使用前后，均须火焰灭菌。即在乙醇灯火焰上彻底烧灼1次，金属棒或玻璃棒部分亦须转动着通过火焰3次，用后烧灼时，先将近环处镍丝置于火焰中，使热导向接种环，如直接将环烧灼，则环上残余菌液可因突然受高热而爆烈四溅，有传染危险。待环上菌液蒸发干涸后，再将接种环以垂直方向于火焰中烧灼灭菌，最后再将金属棒或玻璃棒部分往复通过火焰。接种针用后灭菌时与接种环同。
（3）接种环（针）经火焰后，需待冷却后再沾取标本或放置于工作台上，以防烫死微生物和烧损桌面。
（4）由培养基或试管培养物中沾取标本时，培养瓶口、试管口在打开后及关闭前，应于火焰上通过1～2次，以杀死可能从空气中落入的杂菌和由培养物而来的致病菌。打开瓶塞或试管塞时，应将棉塞上端夹于手指间适当的位置，不得将棉塞任意放置别处。
（5）不染色标本和染色标本观察后，应立即投入消毒液内灭菌。
（6）使用过玻片，务须彻底消除玻片上的染色细菌后再用，否则再次使用时可能做出错误诊断。