客户文章 | 甘氨酸营养缺陷性表皮葡萄球菌小菌落突变株释放的细胞外DNA促进导管相关性感染-技术前沿-资讯-生物在线

文章标题：Extracellular DNA released by glycine-auxotrophic Staphylococcus epidermidis small colony variant facilitates catheter-related infections

发表期刊：Communications Biology

发表时间：2021年4月

影响因子：6.268

合作客户：上海交通大学医学院附属仁济医院

研究背景

小菌落突变株(SCV)是一种具有独特表型及致病特征且生长缓慢的细菌亚群，目前已发现SCV与植入性相关的葡萄球菌感染有着明确联系。由于长期以来导管和许多其他类型的植入性医疗器械引起的感染，被认为是危及生命的医院脓毒症的主要来源，目前迫切需要阐明SCV在导管相关感染发生中的作用机制。

本课题使用基因组学和代谢组学等技术，通过对临床典型的表皮葡萄球菌病例分析（包括稳定型SCV、正常表皮葡萄球菌NC和不稳定型SCV），研究SCV在导管感染中的潜在机制，以及分析生物膜的形成和甘氨酸对细胞生长、肽聚糖连接率的影响。

研究结果表明，表皮葡萄球菌稳定型SCV的突变影响到了各种代谢过程。由于能够快速自溶并且释放eDNA，SCV表现出更强的生物膜形成能力。当SCV与NC共同感染时，SCV可以促进NC的体外生物膜形成和体内存活。本课题为甘氨酸营养缺陷型表皮葡萄球菌SCV在持续性感染中的作用提供了新的思路。

研究结果

1.在表皮葡萄球菌为主的导管感染中SCV呈现高流行率

在128例导管感染病例中，葡萄球菌占总病例的39.1%，其中表皮葡萄球菌占比最为突出，而革兰氏阴性杆菌、棒状杆菌和肠球菌分别仅占18.0%、4.7%和3.9% (图1a)。21.9%的导管感染是由多物种共同感染，且多数是和表皮葡萄球菌相关（14/28,50%），这进一步证明了表皮葡萄球菌在导管感染中起到重要作用(图1a)。

在同一葡萄球菌感染病例中，SCV通常伴随着正常型NC一同出现(41/50,82%)（图1b）。然而大多数SCV的表型并不稳定，在传代培养后很容易恢复成正常大小的菌落（Rev）。因此50个案例中只有8个是稳定型的SCV。

图1. 从临床病例中收集SCV

2.表皮葡萄球菌稳定型SCV具有更强的生物膜形成能力

表型分析显示，稳定型SCV的生物膜形成能力比NC更强（图2a）。此外，在稳定型SCV中也观察到了侵入人类A549细胞和附着于非生物聚苯乙烯表面的能力（图2b、c），而表皮葡萄球菌 Rev表现出与NC相同的表型。由于细菌附着能力与其理化性质密切相关，实验发现稳定型SCV的zeta电位比NC更偏阳性。因此稳定型SCV的附着能力增加可能是细菌和带负电荷的基质之间排斥力降低所致。

图2. 表皮葡萄球菌稳定型 SCV的表型改变

3.表皮葡萄球菌稳定型SCV的基因突变和相关代谢紊乱涉及到了广泛的细胞代谢过程

全基因组测序覆盖了表皮葡萄球菌126个基因，其中61个基因是稳定型SCV独有的， NC和Rev只有细微的差异（图3a）。KEGG通路分析结果注释到了广泛的关键代谢过程，从丙酮酸代谢、柠檬酸循环到嘧啶代谢、甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢（图3b）。此外，存在多个与生物素合成、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成以及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢相关的基因，进一步暗示稳定型 SCV 中的代谢途径可能会受到这些突变的干扰。

代谢分析的PCA结果表明（图 3c），表皮葡萄球菌NC和稳定型SCV两组明显分开，表明稳定型SCV的代谢水平上发生了显着变化。筛选出的39种差异代谢物（DEM）中，28种在表皮葡萄球菌稳定SCV中上调，11种下调（图3d），其中氨基酸及其衍生物占大部分（16/39，41%），其次是核苷酸及其类似物（9/39，23%）。而葡萄球菌细胞壁五肽交联桥的主要成分甘氨酸的含量显着降低，此外丙酮酸和乙酰辅酶A的含量也显着上调。

STITCH的关联网络证明移码突变有可能对相关代谢物产生巨大影响。在图中（图3e），甘氨酸的浓度异常降低而大多数DEM的浓度增加，与移码 SERP1287基因相互关联，其产物是催化甘氨酸合成的丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶（AGXT1）。此外，该网络还暗示乙酰辅酶A水平的急剧增加可能归因于odhA和accA的突变（图3e），这两者都催化了乙酰辅酶A的下游分解反应。由于乙酰辅酶A对丙酮酸脱氢酶复合物的抑制作用，丙酮酸可能因此积累。

图3. 表皮葡萄球菌稳定型 SCV 的基因组学分析和代谢组学分析

4.功能失调的甘氨酸生物合成是导致表皮葡萄球菌稳定型SCV生长缓慢的原因

基因组学和代谢组学分析表明，表皮葡萄球菌稳定SCV的缓慢生长可能是由于甘氨酸短缺造成的。在革兰氏阳性葡萄球菌中，甘氨酸也是肽聚糖交联桥的组成部分，其缺乏会阻止肽聚糖交联，从而降低细胞壁的构建速度。

在培养基中添加外源甘氨酸能够使稳定型SCV生长明显改善，接近正常表皮葡萄球菌NC，而甘氨酸对NC生长的影响很小（图4a），这表明分离到的SCV是甘氨酸营养缺陷型SCV。通过带有TAMRA 的荧光标记的D-氨基酸 (FDAA) 来确定表皮葡萄球菌NC和稳定型SCV的肽聚糖连接率，结果表明在相同的标记时间（30 分钟）内，稳定型SCV产生的TAMRA信号比NC显着减少，说明了其肽聚糖连接速率要慢得多（图4b）。

补充甘氨酸可以将TAMRA 信号恢复到与NC 相同的水平，但对NC没有影响，表明甘氨酸短缺确实通过降低肽聚糖连接率对稳定型SCV生长产生负面影响。

图4. 外源性甘氨酸对表皮葡萄球菌稳定型SCV生长和肽聚糖连接率的影响

5.表皮葡萄球菌稳定型SCV释放的细胞外DNA(eDNA)能够促进生物膜的形成

使用共聚焦激光扫描显微镜成像观察生物膜含量（图5a），SCV具有显着更高的生物膜生物量和平均生物膜厚度（图5b）。通过从稳定型SCV形成生物膜中提取eDNA进行半定量分析，进一步证实了稳定型SCV可通过促进细胞内DNA的释放来影响生物膜基质的组成，尤其是高分子量eDNA（图5c）。然而如 Alexa Fluor 350 偶联小麦胚芽凝集素 (WGA) 和半定量的荧光信号所反映的，表皮葡萄球菌的主要生物膜基质PIA没有显着变化（图5d)。

此外，稳定型SCV与 NC在蛋白酶 K 处理后的生物膜生物量下降相似，而在用 DNase I 处理后，稳定型SCV的生物膜生物量下降幅度显著大于NC（图5e），进一步说明eDNA 释放直接增强了表皮葡萄球菌稳定型SCV的生物膜形成。

图5. 细胞外 DNA (eDNA) 释放的增加促进了表皮葡萄球菌稳定 SCV 的生物膜形成

6.稳定型SCV可促进导管相关感染的物种共同生存

尽管细胞活力下降，表皮葡萄球菌稳定型SCV能够提供生存优势，使整个群体受益。在初始接种剂量下，稳定的SCV对体外NC生物膜形成的影响相当显著（图 6a）。当稳定型SCV 和 NC 在小鼠导管感染模型中共感染时，从植入的导管和周围组织中回收的细菌 CFU 显著高于稳定型SCV 或NC独立感染时的数量（图 6b）。

上海阿趣生物科技有限公司商家主页

地址：嘉定区新培路51号焦点梦想园5层

联系人：高小姐

电话： 400-664-9912

传真：

Email：marketing@biotree.cn

客户文章 | 甘氨酸营养缺陷性表皮葡萄球菌小菌落突变株释放的细胞外DNA促进导管相关性感染

上海阿趣生物科技有限公司商家主页

相关咨询

我们的服务

友情链接

客户文章 | 甘氨酸营养缺陷性表皮葡萄球菌小菌落突变株释放的细胞外DNA促进导管相关性感染

上海阿趣生物科技有限公司 商家主页

相关咨询

上海阿趣生物科技有限公司商家主页