一、研究背景
哺乳动物中雷帕霉素（mTOR）信号通路的靶标是骨骼肌蛋白质合成（MPS）调节的中心。已有研究成功地使用鼠C2C12骨骼肌细胞培养模型来评估氨基酸对mTOR信号传导的影响，并且氨基酸被认为可调节多种mTOR中间体。更重要的是，L-亮氨酸（Leu）在氨基酸中是比较独特的，其能够显著促进mTOR通路的活化和增加MPS。与此同时，乳清蛋白（WP）也具有增加MPS的功能，这可能与乳清蛋白含有高浓度的Leu，并且具有类似于骨骼肌的氨基酸组成有关。
二、研究目的
本项研究的目的是为了研究在超出必需氨基酸（EAA）和Leu介导的信号条件下，WP增强C2C12肌管蛋白合成可能的机制。
（1）比较水解WP与EAA和Leu对C2C12肌管中MPS水平的影响;
（2）研究敲除主要Leu转运蛋白（LAT1）后水解的WP是否还能增加C2C12肌管中的MPS;
（3）研究衍生自水解WP的外泌体是否影响C2C12肌管中的MPS和肥大，以及这是否与mTOR信号传导或牛特异性miRNA与肌肉合成代谢相关的出现相关。
关键词：肌肉蛋白质合成，乳清蛋白，外泌体，亮氨酸
三、样本选取
1. EAA，Leu和WP对MPS的影响实验
对照组：仅HyClone最低必需培养基（MEM）；
EAA实验组：MEM和EAA [75μg/ mL L-组氨酸，240μg/ mL L-异亮氨酸，750μg/ mL L-亮氨酸，130μg/ mL L-苯丙氨酸，250μg/ mL苏氨酸，1μg/ mL L-甲硫氨酸，250μg/ mL L-色氨酸和65μg/ mL L-缬氨酸；
Leu实验组：MEM和750μg/ mL Leu；
WP实验组：MEM和5mg / mL水解的WP。
2. Leu，WP的低、中、高剂量对MPS的影响实验
对照组：无Leu的DMEM;
Leu实验组：无Leu的DMEM分别添加150μg/ mL（低剂量），750μg/ mL（中剂量）及1.5mg / mL（高剂量）的Leu;
WP实验组：1mg / mL（低剂量），5mg / mL（中剂量）及10mg / mL（高剂量）的水解WP。
注意：每个Leu实验组中的Leu含量略高于WP实验组的Leu。
3. LAT1敲除对MPS的影响实验：利用LAT1shRNA敲除LAT1
LAT1对照组：无Leu的DMEM;
Leu实验组：750μg/ mL Leu;
WP实验组：5mg / mL水解的WP。
注意：Leu实验组的Leu含量略高于WP实验组中的Leu。
工具：流式细胞术、Western blot、透射电子显微镜、miRNA芯片
四、研究结果
为了研究水解乳清蛋白（WP）影响肌肉蛋白质合成（MPS）和体外合成代谢的潜在独立机制，奥本大学Michael D.Roberts研究团队进行了以下研究：
（1）3小时和6小时处理的WP、EAA或L- Leu是否影响MPS；以及6小时低、中或高剂量的WP、Leu处理对MPS水平的影响;
（2）6小时处理后， Leu转运蛋白的敲低是否影响WP-和Leu-介导的MPS、雷帕霉素靶标（mTOR）信号应答的变化。
（3）6小时、12小时和24小时处理与未处理（对照组）肌管相比， WP处理分离的外泌体（WP-EXO）是否影响MPS、mTOR信号传导反应；以及经 24小时和48小时处理后肌管直径是否受到影响。
对于所有的处理，分别检查7d后C2C12肌管的分化情况。在实验1中，6h WP处理后MPS水平与对照组相比增加了 46％，与Leu处理组相比增加了24％，与EAA处理组相比增加了25％（图1a）。此外，6h低、中和高浓度WP处理后MPS水平比对应的Leu处理大约增加了40至50％（图1b）。
图1 Leu、EAA或WP处理对肌管MPS的影响
在实验2（LAT shRNA转染的肌管）中，6h
WP处理后MPS水平与对照组相比增加了18％，与Leu处理组相比增加了 19％。在实验3中，12h及24h WP-EXO处理后MPS水平与对照相比分别增加了18％、45％；并且肌管直径与对照组相比， 24h处理组增大了24％，48h处理组增大了40％（图2） 。
图2 24h和48h WP-EXO处理及对照组肌管直径（μm）
WP-EXO处理似乎没有通过mTOR信号传导操作；相反，它们增加了真核起始因子4A的mRNA和蛋白水平。24h WP-EXO处理后的牛特异性microRNA在肌管中富集（主要是miR-149-3p，miR-2881），但与肥大基因靶标无关.
五、研究结论
总之，本研究表明水解WP-EXO增加了骨髓MPS和体外合成代谢，这可能与其最终增加翻译起始因子水平而不是增强mTOR信号或涉及牛特异性microRNA的未知机制相关。
C. Brooks Mobley,et al.(2017)Whey protein-derived exosomes increase protein synthesis and hypertrophy in C2C12 myotubes. Journal of Dairy Science. doi.org/10.3168/jds.2016-11341.
本研究中的miRNA微流体芯片由联川生物提供
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