食管鳞状细胞癌（OSCC）作为食道癌最常见的亚型（84%），仍然是全球肿瘤死亡的主要原因。东亚特别是中国的OSCC具有较高的发病率。由于缺乏典型的临床症状和早期诊断技术，许多OSCC患者被诊断为晚期，不得不接受以顺铂（DPP）为基础的化疗，但其高耐药率限制了临床应用疗效，其源头机制尚不清楚。本研究的目的是阐明信号传递和代谢异常在食管鳞癌耐药中的作用，寻找提高顺铂化疗敏感性的靶向药物。
2023年3月，同济大学附属东方医院的徐美东教授与团队在Journal of Experimental & Clinical Cancer Research (IF=12.658)期刊上发表题为“Targeting IGF1R signaling enhances the sensitivity of cisplatin by inhibiting proline and arginine metabolism in oesophageal squamous cell carcinoma under hypoxia”的文章，该研究揭示了通过IGF1R途径上调ASS1和PYCR1的表达，靶向精氨酸和脯氨酸代谢，促进OSCC对DDP的耐药，提示靶向IGF1R信号转导的Linsitinib可能为DPP耐药的OSCC患者提供有前景的联合治疗选择。（麦特绘谱提供Q300全定量代谢组检测服务）
OSCC患者IGF1R的表达在DDP耐药中的作用
研究者通过转录组测序（RNA-seq）、肿瘤基因组图谱（TCGA）数据库、免疫组织化学（IHC）、实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）和免疫印迹（WB）检测食管鳞癌组织中上调基因的表达。分析发现食管鳞癌组织中胰岛素样生长因子-I受体（IGF1R）表达差异最显著，并且高表达水平的IGF1R与肿瘤进程和预后差呈正相关，与缺氧条件下DDP抵抗有关。
随后通过干扰IGF1R的表达探究其异常表达在DDP耐药中的作用，体内体外实验均发现了适度抑制OSCC增殖的能力。使用linsitinib联合DDP对OSCC细胞的增殖具有协同抑制作用，这些协同效应在体外和体内也得到了体现。总的来说,抑制IGF1R的表达可显著提高OSCC细胞对DDP的敏感性。
图1. 体内和体外抑制IGF1R可增强OSCC在对DDP的敏感性
耐药机制探讨
代谢适应有助于癌细胞在缺氧微环境中的发育。接下来，通过整合代谢组学和基因组学分析，旨在找到缺氧条件下活化的代谢酶。一方面，在缺氧条件下，精氨酸琥珀酸合成酶1（ASS1，精氨酸代谢关键酶）和吡咯烷-5-羧酸还原酶1（PYCR1，负责脯氨酸合成）在肿瘤组织和细胞系中均有高表达。另一方面，代谢组学分析（Q300全定量代谢组技术）在细胞系中发现了45种异常积累的代谢物，通路分析显示TCA循环和FAO被抑制，而糖酵解增强，这可能是缺氧导致ATP生成的稳态机制；另外，天冬氨酸-精氨酸-脯氨酸代谢也得到增强。该团队此前研究天冬酰胺合成酶（ASNS），发现在OSCC中存在异常的天冬氨酸代谢，因此，本研究主要关注通过ASS1和PYCR1改变精氨酸/脯氨酸代谢。
首先发现ASS1和PYCR1在OSCC细胞系中表达最高，这与IGF1R一致，缺氧也以时间依赖性的方式刺激了这两种酶的表达。此外，与癌旁组织相比，OSCC患者组织中ASS1/PYCR1蛋白表达上调，临床上ASS1/PYCR1的高表达与肿瘤分期以及OSCC患者的无进展生存期相关，并且ASS1和PYCR1的表达与IGF1R呈正相关。那么ASS1和PYCR1是否受IGF1R的调控？
图2. OSCC中代谢酶ASS1和PYCR1上调
进一步探究IGF1R调控ASS1和PYCR1表达的机制，通过体内体外抑制IGF1R的表达，发现ASS1/PYCR1均下调。信号通路分析发现，Ras/MAPK通路（促进多种细胞功能）和JAK/STAT通路的磷酸化水平显著降低。此外，JAK和ERK1/2的下调伴随着ASS1/PYCR1表达的降低，证实IGF1R通过这两条信号通路调控ASS1/PYCR1。进一步确定这些转录因子（TFs）在缺氧时调节肿瘤代谢中的作用，发现只有磷酸化的c-MYC与ASS1/PYCR1通路和IGF1R通路有明确的调节关系。因此，缺氧条件下ASS1和PYCR1的表达改变是由IGF1R信号通路–c-MYC轴诱导的。
图3. IGF1R通过其信号通路- c- MYC轴在缺氧条件下调控ASS1和PYCR1的表达
靶向精氨酸代谢/脯氨酸代谢的作用
为了进一步研究ASS1和PYCR1增强在DDP耐药中的作用，通过干扰ASS1和PYCR1的表达，观察到在体外和体内的增殖能力受到轻微抑制。与IGF1R抑制剂linsitinib的作用一致，shASS1/PYCR1在体外和体内均表现出与DDP协同抑制肿瘤增殖的作用。
利用代谢组学分析ASS1和PYCR1在代谢重编程中的作用，ASS1和PYCR1抑制诱导的异常与精氨酸/脯氨酸代谢密切相关。更具体地说，shRNA-PYCR1细胞中的脯氨酸水平降低，shRNA-ASS1细胞中的精氨酸水平降低。此外，与对照组（control+DDP）相比，补充外源精氨酸后shASS1 + DDP或linsitinib + DDP被抑制的增殖能力得到部分恢复。这些数据表明，IGF1R在缺氧条件下通过调节ASS1促进精氨酸代谢，导致精氨酸积累，作为维持化疗期间增殖能力的生物合成前体。
然而，外源脯氨酸在shPYCR1 + DDP或linsitinib + DDP组中未能挽救增殖，说明增强的脯氨酸代谢可能以其他方式促进肿瘤细胞对DDP的抵抗，而不是脯氨酸的积累。
已有研究证实，PYCR1催化脯氨酸合成伴随着NAD+的生物合成，在维持氧化还原平衡中起着关键作用。理论上，低氧对TCA循环的损害不仅会导致ATP生成减少，还会导致多种中间代谢物在TCA循环中的积累减少，从而抑制合成代谢前体的合成，最终抑制细胞增殖。那么通过PYCR1增强脯氨酸代谢的NAD+是否补偿了TCA循环？结果正如预期，PYCR1表达的减弱抑制了NAD+水平。最后，在DDP+shPYCR1中添加外源性丙酮酸，逆转了shPYCR1+DDP对细胞增殖的抑制作用。因此，IGF1R通过调节PYCR1促进脯氨酸代谢，提供足够的NAD+维持TCA循环中的氧化还原平衡，最终造成化疗期间的细胞增殖，靶向IGF1R信号通路可逆转其影响。
图4. 低氧条件下IGF1R通过靶向的精氨酸和脯氨酸代谢降低OSCC细胞对DDP的敏感性
小结
本研究发现激活的IGF1R通路在低氧微环境下的OSCC化疗耐药中发挥重要作用。临床上，IGF1R表达增强与OSCC患者肿瘤分期高、预后差相关，其抑制剂linsitinib在体内和体外均与DDP治疗有协同作用。由于缺氧常导致代谢重编程，研究人员通过代谢组学分析进一步了解到，异常的IGF1R通路通过c-MYC的转录活性促进代谢酶ASS1和PYCR1的表达。具体而言，ASS1的表达增强促进精氨酸代谢以进行生物合成代谢，而PYCR1则激活脯氨酸代谢以维持氧化还原平衡。最终，异常信号传递结合代谢重编程导致DDP耐药性。因此，靶向IGF1R通路及相关代谢改变可能改善DDP在OSCC中的治疗效果，或可成为一种基于DDP的更有效的化疗新策略。
图5. 本研究图解总结
参考文献
Kang Fang et al. Targeting IGF1R signaling enhances the sensitivity of cisplatin by inhibiting proline and arginine metabolism in oesophageal squamous cell carcinoma under hypoxia. J Exp Clin Cancer Res. 2023 Mar 28;42 (1):73.
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