细胞凋亡系类产品

    细胞凋亡（apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，通过细胞内基因及其产物的调控而发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。细胞凋亡对胚胎发育及形态发生（morphogenesis）、组织内正常细胞群的稳定、机体的防御和免疫反应、疾病或中毒时引起的细胞损伤、老化、肿瘤的发生进展起着重要作用，并具有潜在的治疗意义。

    细胞凋亡途径中各事件的发生是有时序性的，即各事件按先后顺序依次发生，最终导致凋亡小体的出现，细胞随着发生凋亡。典型特征为：细胞膜PS（磷脂酰丝氨酸）的外翻；线粒体膜电位的丧失；细胞核凝缩和断裂。

一、PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测(Annexin V法)：

    在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca2+ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。用荧光素（FITC、Alexa Fluor488等）标记的 Annexin-V 作为探针，利用流式细胞仪或荧光显微镜可检测细胞凋亡的发生。另外，碘化丙啶(propidine iodide, PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞和死细胞，PI 能够透过细胞膜而使细胞核红染。因此将 Annexin-V 与 PI 匹配使用，就可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。

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二、线粒体膜电位变化的检测

在细胞凋亡的过程中往往伴随着线粒体跨膜电位的破坏，这被广泛认为是细胞凋亡级联反应过程中最早发生的事件之一。它发生在细胞核凋亡特征（染色质浓缩、DNA断裂）出现之前，一旦线粒体跨膜电位崩溃，则细胞凋亡不可逆转。线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料如 Rhodamine 123、JC-1、JC-10等可结合到线粒体基质，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。

JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位△Ψm 的理想荧光探针，表现出电势依赖性的积聚在线粒体内。正常线粒体内，JC-1聚集在线粒体基质中形成聚合物，聚合物发出强烈的红色荧光（Ex=585 nm, Em=590 nm）；而凋亡细胞，线粒体跨膜电位去极化，JC-1从线粒体内释放，浓度降低，逆转为发射绿色荧光的单体形式。因此颜色的变化非常直接的反映出线粒体膜电位的变化。线粒体的去极化程度也可以通过红/绿荧光强度的比例来衡量。JC-1的流式检测是比较常见的一种方法。

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三、TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling）

    细胞凋亡晚期， 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将荧光素/酶标记的dUTP结合到DNA的3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling， TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3-OH形成，很少能够被染色。TUNEL实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。

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