如何利用NGS技术研究转录组

转录组（transcriptome）是指在某一特定的生理条件下，细胞、组织或生物体内所有转录产物的集合，即转录出来的所有RNA总和，包括编码RNA（即mRNA）和非编码RNA（如tRNA、rRNA、miRNA、lncRNA、circRNA）等多种不同类型的RNA分子。

转录组学（transcriptomics）是一门从整体水平上研究转录组基因表达和转录调控的学科，包括研究基因表达水平变化、转录本的种类、定位、注释、可变剪接以及每个基因转录本在基因组中的结构和功能研究等。

目前用于转录组研究的方法主要包括基于杂交技术的表达谱基因芯片技术和高通量RNA测序技术。

相对于传统的表达谱基因芯片技术，高通量RNA测序无须预先针对已知序列设计探针，即可对研究物种的整体转录组进行检测，在分析转录本的结构和表达水平的同时，还能发现未知转录本和稀有转录本，精确地识别可变剪切位点，检测融合基因, 发现新的长非编码RNA（lncRNA）以及环状RNA（circRNA），提供更为全面的转录组信息。

转录组学测序分类

目前常见的高通量测序在转录组学中的应用包括mRNA-seq、lncRNA-seq、small RNA-seq/ miRNA-seq、circRNA-seq等。

1.mRNA-seq

mRNA-seq可进行差异表达分析、推测mRNA结构、识别可变剪切位点以及cSNP（编码序列单核苷酸多态性）、解析RNA编辑等。mRNA-seq的过程基本包括样本RNA提取、建库前的样本质检、文库构建、文库质控、上机测序、数据分析等。

图1：mRNA-seq建库流程图

测序完成后，需要经过生物信息学分析将高通量测序数据包含的信息解读出来，包括测序数据的质量控制、数据比对、转录本拼接及后续的个性化分析。

2. lncRNA-seq

lncRNA（长链非编码RNA）是一类转录本长度超过200nt、不编码蛋白质的RNA。lncRNA在表观遗传学调控、转录水平调控、转录后水平调控发挥着重要作用。高通量测序技术被广泛用于lncRNA的鉴定、表达分析和功能预测。

大部分长链非编码RNA与编码RNA相似，具有5‘端帽子结构和3’端poly（A）尾巴，但同时也存在一定数目的长链非编码RNA并不带有poly（A）尾巴。所以构建lncRNA的测序文库时，提取出的总RNA需用rRNA去除的方式来富集lncRNA。

图2：rRNA去除原理（图片来自international.neb.com）

3. small RNA-seq/ miRNA-seq

小RNA（small RNA）主要包括miRNA、siRNA和piRNA，参与诱导基因沉默、细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。通过高通量测序，可以发掘、鉴定和定量出任何物种全基因组水平的小RNA图谱、挖掘新的miRNA分子、预测靶基因、鉴定样品间差异表达分析。

小RNA测序建库前也需要对RNA样本进行质检，质检合格后可以选择不同的方法建库，常见的小RNA建库流程是：3‘端加SR Adapter→反转录引物杂交→ 5’端加接头→ 反转录→ PCR扩增→ PCR产物纯化→ 文库片段大小选择→ 检验文库的质量。与长链RNA的建库流程不同，小RNA建库无需片段化，先加通用接头再合成cDNA，index通过PCR扩增完成。小RNA文库的片段选择建议使用聚丙烯酰胺凝胶或者Pippin Prep进行片段筛选。文库构建完成质检合格便可安排上机测序，传统一般是用双端PE50的策略。

图3：small RNA-seq建库流程图（图片来自questgenomics.com）

4. circRNA-seq

环状RNA（circRNA）分子呈封闭环状结构，不受RNA外切酶影响，表达更稳定，不易降解。近几年的研究表明，circRNA在生物的生长发育、对外界环境的抵御等方面具有重要的调控作用。circRNA可竞争性结合miRNA，发挥ceRNA的调控功能，调控基因表达。近年来还发现与疾病的发生和发展密切相关，在疾病诊断标记物等方向具有很大的应用前景。

circRNA的建库方法采用去除rRNA，去除线性RNA的策略富集circRNA，并用链特异性建库以区分circRNA来源与基因的正负链。

图4：circRNA-seq建库流程图

结语

高通量测序技术应用于转录组学，给转录组学带来了更全面、更准确、更低成本的数据，使得转录组学在临床应用如疾病相关基因功能的研究或分子标志物的发现等方面能够更进一步。转录组测序对于疾病发病机制研究，以及疾病的诊断、预后等发挥了重要作用。利用高通量测序技术，人们已成功实践基因表达模式分析和融合基因的检测，相信未来转录组测序会给人类带来更多益处。

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