m5C（5-甲基胞嘧啶，5-methylcytosine）是一种较为常见的 RNA 修饰类型。普通的胞嘧啶（C）在 NSUN3 等 m5C 甲基转移酶（m5C Writer）的催化下，以 SAM （S-adenosyl-l-methionine）为甲基来源，形成 m5C 修饰。其主要测序研究方法包含基于抗体富集的 MeRIP-seq 法以及基于化学转化的BS-seq。f5C（5-甲酰胞嘧啶， 5-formylcytosine ）是在 m5C 修饰的基础上进一步氧化得到的产物，该过程由 ALKBH1 酶催化。f5C 在早前的研究中见诸哺乳动物线粒体的 tRNA 当中。最近，德国癌症研究中心等机构的研究者在 Nature 杂志上发文揭示了线粒体 tRNA 中特定位点上的 m5C 和 f5C 修饰对线粒体能量代谢的调控作用，进而促进**的转移。该发现为癌症治疗提供了一条基于抑制线粒体 m5C 修饰的新思路。
论文标题：Mitochondrial RNA modifications shape metabolic plasticity in metastasis
相关方法：tRNA m5C BS-seq
图 tRNA 第34位 m5C 和 f5C 修饰示意图
线粒体 tRNAMet 上的 m5C 和 f5C 修饰
研究者在重亚硫酸盐测序（BS-seq， bisulfite sequencing）的基础上进行了改进，实现了对 m5C 和 f5C 两种 RNA 修饰同时进行单碱基分辨率的检测。作者使用该方法对多种*细胞进行了测序，测序结果显示，tRNAMet 上的第34位碱基是所有线粒体 tRNA 中**一个可以发生 f5C 修饰的位点，而该位点恰好位于 tRNA 反密码子环上的反密码子第3位，即摇摆位（wobble position）。将同时检测 m5C 和 f5C 的测序结果与*检测 m5C 的 BS-seq 测序结果进行比对，研究者发现，对于实验中所用的所种*细胞， 在 tRNAMet 的第 34 位上，有超过 50% 的 m5C 修饰，以及约 35% 的 f5C 修饰。若在*细胞中敲降 m5C Writer 基因 NSUN3，则在 tRNAMet 的第 34 位上 m5C 和 f5C 两种修饰的比例都**降低。以上证据说明，人类*细胞当中 tRNAMet 的第 34 位上的 m5C 和 f5C 修饰依赖于 NSUN3 酶的存在。
线粒体 m5C 修饰对**转移不可或缺
通过在小鼠体内进行*细胞的原位移植实验，研究者发现，虽然缺失 NSUN3 酶的细胞移植仍然能造成**的发生和生长，但却无法造成**转移（Metastasis）。因此，作者认为线粒体 tRNAMet 第34位上的修饰对于**转移是不可或缺的。m5C 修饰调控线粒体功能
在敲降了 NSUN5 的*细胞中，研究者通过 OP-puro 实验检测了新生肽链的翻译效率，发现 NSUN5 敲降导致的低甲基化阻碍了线粒体蛋白的翻译。研究者对 NSUN5 敲降的细胞进行了质谱分析，发现三羧酸循环（Tricarboxylic acid cycle, TCA）中的代谢产物减少。NSUN5 敲降细胞中的线粒体形态亦发生变化，外形变得更圆，且单个线粒体内的嵴数减少。因此，作者认为*细胞线粒体 tRNAMet 上的 m5C 和 f5C 修饰起到了细胞能量感应器的作用。
缺失m5C和f5C的**组织偏好糖酵解
研究者在缺失 NSUN3 酶的原生**组织当中进行免疫组化实验发现，GLU1（glucose transporter 1，葡萄糖转运蛋白-1）的 RNA 和蛋白质水平均发生下调。在对照组织与缺失 NSUN3 酶的原生**组织之间，差异基因主要集中于线粒体能量代谢相关的基因，例如 NADH 脱氢酶、氧化还原酶以及电子传递链相关的基因。针对这些差异基因所的 GO 分析显示，富集程度靠前的条目多与线粒体以及核糖体相关。GSEA 分析结果亦显示，氧化磷酸化（Oxidative Phosphorylation, OXPHOS）相关的基因集的富集程度在确实 NSUN3 酶的组织中下调。研究者还在多种*细胞中检测了 ATP 的消耗组成情况，发现 NSUN3 敲降将会提升糖酵解来源的 ATP 比例、降低氧化磷酸化来源的 ATP 比例。
线粒体m5C修饰促进**侵袭
作者进一步在 3D 培养系统中对**组织进行培养，并使用特殊染料 MitoTracker CMXROS 来标记线粒体膜电势（Mitochondrial Membrane Potential, MMP）。结果显示，**小体（Tumoroids）表层的细胞拥有较高的 MMP，但在 NSUN3 敲降的**小体中，表面这层 MMP 值高的细胞消失了，暗示着 NSUN3 的缺失可能限制了**表层细胞通过氧化磷酸化获取能量，进而局限了**侵袭的能力。研究者在 3D 胶原蛋白矩阵中测试了**小体的侵袭能力，发现侵袭先导细胞（Invading leader cells）具有较高的 MMP 以及较长的线粒体，且 NSUN3 酶的缺失将会减少单个**小体所产生的先导细胞个数。因此，作者认为线粒体内 tRNAMet 上的第34位 m5C 修饰可以促进**侵袭。
m5C通过CD36驱动的**转移
早前的报道显示，在人类口腔*中，有一类**细胞同时表达 CD44 和 CD36 蛋白。由于 CD36 是一类位于线粒体外膜上的蛋白，引发了作者的研究兴趣。作者分选了 CD44 高表达且 CD36 也高表达的**细胞，并在此基础上再分选出 MMP 值*高的亚群，记作“CD44HCD36H”细胞。敲降 NSUN3 会降低 CD44 和 CD36 的 mRNA 水平，使得CD44HCD36H 细胞下降了三倍之多。研究者进一步在小鼠体内进行*细胞的原位移植实验，在小鼠的淋巴结里检出了转移的 CD44HCD36H 细胞。综上所述，作者认为线粒体中的 m5C 修饰可通过 CD36 驱动**的转移。
CD44HCD36H 先导转移细胞的蛋白质组学特征
研究者对 CD44HCD36H 先导转移细胞进行了定量蛋白组学实验，并对检测到的蛋白进行了无监督聚类，其中第3类细胞与 CD44 和 CD 36 的表达量表现出*强的正相关关系。针对聚类结果中的第3类蛋白进行 GO 分析，排名在前的条目多与线粒体活动相关。作者还在缺失 NSUN3 酶的*细胞中过表达 CD36，发现 CD36 的过表达并不足以使得氧代谢率回升，亦不足以促进**小体的生长。总之，CD36 信号虽可以促进**转移，但仍需要 NSUN5 的正常表达作为前提条件。
代谢重编程是动态可逆的
在 NSUN3 敲降的*细胞中，作者持续检测了 CD44HCD36H 细胞的数目。在敲降实验后的前 6 天，CD44HCD36H 细胞数目持续下降，但活细胞的总数并不下降。这说明 NSUN3 酶确实只影响细胞的转移能力，但不影响细胞的生长或死亡。
NSUN3基因在**中的作用
作者对 78 份头颈鳞*（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）**组织进行 NSUN3 免疫组织染色以及 qPCR 定量，发现 NSUN3 水平与原发**的更高病理分期相关。作者在 TCGA 公开数据中分析了 500 份头颈鳞*的数据，根据 NSUN3 驱动表达的基因可以在无监督聚类后将患者分为四组，其病理分期和诊断时淋巴结转移现象的存在随着 NSUN3 水平逐渐增加。组织免疫染色结果显示，NSUN3蛋白水平在**侵袭的前缘*高。因此，作者认为 NSUN3 的活性在接近**-基质边界*高，并在那里**侵袭发生。
线粒体调节**转移
由于线粒体的蛋白翻译机制与原核生物存在相似性，作者希望可以通过使用***来减弱线粒体的蛋白翻译，模拟 NSUN3 缺失所造成的对**细胞转移的抑制作用。研究者将多种**细胞暴露于***环境并检测其侵袭能力。CAP（氯霉素）、LIN（利奈唑胺）、TIG（加环素） 和 DOX （多西环素）这几类***可以减少**小体当中先导细胞的数量，并减少葡萄糖的摄取，CD44HCD36H 细胞的数目也减少约两倍，但细胞活力并不受这些***处理的影响。*后，研究者还在小鼠体内验证了*****的效果，证明抑制线粒体翻译可以造成与 NSUN3 酶敲降类似的效果，阻止**细胞的转移。
小 结
作者通过对**细胞线粒体中的 tRNAMet 的 RNA 修饰测序，发现了第 34 位上特异的 m5C 和 f5C 现象，并将这一位点的修饰现象与**细胞的转移能力关联起来。作者认为，抑制线粒体中的 m5C 的形成，可以作为阻止原发**转移的一个**切入点。
时至**，仍然有许多类型的生物样品尚未被开展过 m5C 修饰的研究，更缺乏对单个 m5C 修饰位点的生物学功能的认识。m5C 修饰的功能研究，尚有大量空白等待您去填补。
云序生物m5C甲基化研究五大模块
01 m5C RNA甲基化测序
m5C RNA甲基化测序（m5C-seq）
对m5C RNA甲基化，目前*流行的检测手段为m5C-Seq技术，适用于m5C RNA甲基化谱研究，快速筛选m5C RNA甲基化靶基因。云序可提供mRNA和多种非编码RNA的m5C测序：
- m5C 全转录组测序（涵盖mRNA，LncRNA，circRNA）
- m5C LncRNA测序（涵盖LncRNA和mRNA）
- m5C Pri-miRNA测序（涵盖Pri-miRNA和mRNA）
- m5C mRNA测序
02检测整体m5C RNA甲基化水平
LC-MS/MS检测整体RNA甲基化水平
**高效，可以实现一次检测，9类修饰水平检测，一步到位。
03 m5C RNA甲基化上游酶的筛选
m5C RNA甲基化相关酶PCR芯片
寻找上游直接调控m5C RNA甲基化的甲基转移酶。
04 m5C RNA甲基化靶基因验证
meRIP-qPCR
云序提供各类不同修饰的meRIP-qPCR服务，可针对mRNA，lncRNA，环状RNA等不同类型的RNA分子进行检测，低通量验证RNA修饰靶基因表达水平。
05 机制互作研究
5.1 RIP-seq/qPCR
筛选或验证RNA修饰直接靶点，研究RNA修饰靶基因的调控机制。
5.2 RNA pull down -MS/WB
筛选或验证目标RNA互作基因或蛋白，研究相应的分子调控机制。
5.3 双荧光素酶实验
验证两基因互作，研究相应的分子调控机制。
-- 云序生物服务优势 --
优势一：云序累计支持客户发表220+篇SCI论文，合计影响因子1900分+
优势二：至今完成数千例RNA甲基化测序样本，**覆盖医口、农口等各类样本。
优势三：**检测mRNA和各类非编码RNA（circRNA，lncRNA，Pri-miRNA等）。
优势四：**提供m5C一站式服务：m5C整体水平检测、m5C-seq、MeRIP-qPCR验证、RIP和RNA pull-down等。
优势五：率先研发超微量MeRIP测序技术，RNA量低至500ng起。
优势六：提供多种RNA修饰测序服务，包含m6A、m5C、m1A、m7G、m3C、m6Am、O8G、ac4C乙酰化和2'-O-甲基化测序。
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