多系统萎缩 （MSA） 是一种散发的、多见于成人的进展性神经退行性疾病，其临床特征表现为自主神经衰竭、帕金森综合征和共济失调的各种组合。MSA 是一种α突触核蛋白相关疾病，其神经病理学标志是由错误折叠的α-突触核蛋白组成的神经胶质细胞质包涵体。纹状体黑质系统和橄榄脑桥小脑系统中的选择性萎缩和神经元丢失是MSA-帕金森病型和MSA-小脑型两种主要运动表型的基础。

腺相关病毒( adeno-associated virus，AAV) 是一类细小病毒，基因组为单链DNA，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。通常需要腺病毒或疱疹病毒帮助其在体内复制扩增。AAV相比于其他病毒载体具有表达时间长、扩散性强、特异性强、安全性高、免疫原性低、高稳定性等特点。

稳转株即稳定表达的细胞株，指基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。通过将外源DNA/shRNA克隆到带有某种抗性基因的载体上，重组载体被转染至宿主细胞并整合到其染色体中，并能随细胞分裂稳定传递下去，再用载体中所含抗性基因进行筛选。

试验流程：

1、试剂耗材

AAV-MBP-hm-α-Syn病毒、重组Anti-Alpha-synuclein (phospho S129)、培养基、血清、PBS、胰酶、Poly brene、培养瓶、24孔板。

2、MBP病毒转染

1) 培养OLN-93（大鼠少突胶质前体细胞），培养体系为DMEM+10%FBS；

2) 确定MOI值，可通过查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI值也可参考查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适MOI；

3) 将细胞铺板、计数，将需要的细胞量接种于合适的孔板中；

4) 待细胞生长至70-80%进行转染，通过接种的细胞量及预实验得来的MOI来计算添加的病毒体积，并感染病毒；

5) 转染48h后撤病毒，观察转染效率，显微镜拍照。

（注：转染过程中，细胞免疫力较低，容易污染。）

小结：通过设置病毒梯度，OLN-93与MBP病毒共同培养48h，我们发现7.0μM的病毒转染效率最好。

3、pSer129染色

重组Anti-Alpha-synuclein (phospho S129)：该抗体检测在Ser129上磷酸化的α突触核蛋白，参与多巴胺释放和运输的调节，诱导微管相关蛋白tau的纤颤化，降低神经元对各种凋亡刺激的反应，导致半胱天冬酶-3激活减少。

小结：通过转染MBP病毒建立稳转细胞株：与Control组相比，0.1μM组、1.0μM、7.0μM组阳性细胞率较低，有极显著差异，具有统计学意义(p<0.001)。

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