发表期刊：Cell Death & Disease
影响因子：8.469
发表时间：2022年4月13日
研究方法：RNA-seq，Circle-seq，环状 DNA Sanger 测序验证，环状DNA定量PCR
文章链接：Global characterization of extrachromosomal circular DNAs in advanced high grade serous ovarian cancer
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技术路线
研究内容
1、Circle-seq分析检测HGSOC样品中的eccDNAs为了检测HGSOC配对的原发组织和转移组织(HGSOC-M)中的eccDNAs，作者对四对标本进行了环状 DNA 测序(Circle-seq)分析。图1列出了Circle-seq分析方法的主要步骤。首先，使用柱层析分离总环状DNA。分离的样品用内切酶和限制性核外切酶处理，以去除线粒体环状DNA和残留的线性染色体DNA。然后使用φ29 DNA聚合酶通过滚动循环扩增纯化后的eccDNAs，扩增产物最终通过高通量测序定位到参照基因组(UCSChg19)进行分析。circle-map软件分析结果显示，所有样本中共鉴定出194955个eccDNAs，说明在HGSOC组织中有丰富的eccDNA表达。
图1 Circle-seq示意图
2、在HGSOC样本中检测到的eccDNAs的特征
然后，作者对HGSOC原发组织和转移组织的eccDNA以下特性进行了表征：表达频率、长度分布、GC含量和基因组分布。首先，作者发现这些eccDNAs来源于所有的染色体(图2A)。比较每个样本中eccDNAs的表达频率，发现在原发肿瘤中为32113~48817，在转移性肿瘤中为12871~70530不等。其次，大小分布分析显示，大小小于1000bp的eccDNAs在HGSOC组织中为优势亚型。HGSOC原发组织eccDNAs平均大小为388bp，转移性组织平均大小为379bp，均在316~398bp左右达到峰值(图2B)。第三，与其他基因组区域相比，原发组织和转移组织的eccDNA序列中GC含量的富集程度更高(图2C)。第四，通过将eccDNAs定位到不同的基因组元件(图2D)、重复元件(图2E)和不同的染色体(图2F)，探讨了eccDNAs的可能起源。在这两组样本中，基因丰富的染色体与eccDNA形成频率之间没有普遍的相关性(图2F)。值得注意的是，eccDNAs在5‘UTR区和3’UTR区，以及重复元件如卫星，长分散元件LINEs，和短分散元件SINE处丰富，表明在HGSOC组织中，这些区域而不是高基因丰度区域更优先生成eccDNAs。
图2 在HGSOC样本中检测到的eccDNAs的特征
3、eccDNAs在HGSOC配对的原发和转移组织中差异表达
根据Circle-seq测序结果，与HGSOC的原发组织相比，在转移组织中筛选出464个差异表达的eccDNAs，筛选阈值为|FC|≥2和P<0.05(图3A)。为了证实eccDNAs的存在，作者采用扫描电镜显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)观察了HGSOC样本以及SKOV3、A2780和OVCAR3卵巢癌细胞系中的eccDNAs。可视化清楚地显示了HGSOC组织和三种卵巢癌细胞系中eccDNA直观的环状结构(图3B，C)。
图3 eccDNAs在HGSOC的配对原发和转移组织中差异表达
4、验证在HGSOC原发性和转移性组织样本中差异表达的eccDNAs
作者还通过RNA-seq分析确定了同一原发性和转移性HGSOC肿瘤之间的差异表达基因(DEGs)(图4A,B)。与原发组织相比，在转移组织中鉴定得到了219个DEGs，包括91个上调mRNA和128个下调mRNA。此外，将Circle-seq数据与RNA-seq结果进行联合分析，发现64个改变的候选基因存在重叠(图4c)。同时，作者对这些差异表达的eccDNAs和mRNA进行GO和KEGG分析，发现这些候选基因的主要潜在下游功能包括代谢调节、血管生成调节和细胞死亡等。根据生物信息学分析预测的癌症相关功能和eccDNAs的表达程度，作者选择了8个eccDNA进行进一步的研究。这些eccDNA按其基因起源命名，如DNMT1circle10302690-10302961。
此外，作者应用环状 DNA Sanger 测序来确定检测到的eccDNAs的连接位点，确定了以下6个eccDNAs的准确基因来源：
TIAM1circle32908504-32909034/TIAM1circle32908506-32909036
PKNOX1circle44449654-44450167
DNMT1circle10302690-10302961
ABI3BPcircle100704857-100705232
RORAcircle60976547-60977116/RORAcircle60976549-60977118(图4D)。
为了进一步验证测序结果，作者使用另外20对HGSOC的原发性和转移性组织进行了环状DNA定量PCR验证(图4E)。结果显示，DNMT1 mRNA和DNMT1circle10302690-10302961是在HGSOC原发和转移组织中表达水平变化最大的候选基因，因此选择DNMT1circle10302690-10302961进行进一步研究。
图4 验证eccDNAs在HGSOC配对的原发和转移组织中差异表达
5、与HGSOC的原发组织相比，DNMT1circle10302690-10302961在转移组织中表达下调
eccDNA DNMT1circle10302690-10302961由19号染色体反义链上的一个DNMT1基因片段(chr19：10302690-10302961)环化形成。为了验证其特殊的环状结构，在SKOV3、A2780和OVCAR3细胞系中，对DNMT1circle10302690-10302961进行反向PCR检测。结果显示，DNMT1circle10302690-10302961在基因组DNA中没有出现(图5A)。在SKOV3、A2780和OVCAR3细胞中，使用特异性cy3标签探针，也发现了DNMT1circle10302690-10302961的存在(图5B)。代表DNMT1circle10302690-10302961的信号主要在染色体外观察到，确定了该eccDNA的染色体外特征。然后，作者通过FISH和BaseScope检测验证了DNMT1circle10302690-10302961在HGSOC原发和转移组织中的表达(图5C，D)，证实了与HSGOC的原发组织相比，其表达水平在转移性组织中显著下调。
图5 与HGSOC的原发组织相比，DNMT1circle10302690-10302961在转移组织中表达下调
6、DNMT1circle10302690-10302961的减少与HGSOC患者预后不良相关
采用4个在线数据库(TCGA、GSE9891、GSE26712和GSE102073)分析DNMT1表达水平与HGSOC患者预后的关系。Kaplan-Meier生存分析显示，DNMT1的低表达与卵巢癌患者的短总生存期(OS)相关(图6A)。由于eccDNA DNMT1circle10302690-10302961和DNMT1 mRNA在HGSOC转移性组织中的表达均降低，作者推测DNMT1circle10302690-10302961可能也具有这样的预后价值。因此，作者通过FISH检测证实了80例HGSOC患者的FFPE组织中DNMT1circle10302690-10302961的表达水平。根据特异性探针信号的强度和范围，将所有病例分为DNMT1circle10302690-10302961的低表达组和高表达组(图6B)。进一步的Kaplan-Meier生存分析显示，原发性HSGOC肿瘤中DNMT1circle10302690-10302961的低表达，与较短的OS(图6C)和较低的无病生存(DFS)率(图6D)相关。研究结果表明，DNMT1circle10302690-10302961的减少是HGSOC的一个不良预后因素。
图6 DNMT1circle10302690-10302961的减少与HGSOC患者预后不良相关
小 结
本文利用Circle-seq分析得到了HGSOC原发和转移性组织的eccDNA表达谱，并通过与RNA-seq联合分析鉴定了一个名为DNMT1circle10302690-10302961的新型eccDNA。与HGSOC原发肿瘤相比，DNMT1circle10302690-10302961已被证实是转移性肿瘤中下调最显著的eccDNA。此外，作者还确定了DNMT1circle10302690-10302961在HGSOC诊断中的临床价值，即DNMT1circle10302690-10302961的减少与HGSOC患者预后不良相关，它可以作为HGSOC转移治疗的一个可靠的临床治疗靶点。
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